癌症手脚一种细胞荒谬增殖的疾病，是全球主要的众人卫生问题。癌症的诱因相称复杂，是胞内多种调控通路的突变和微环境共同作用的闭幕，其中细小RNA（miRNA）是连年来被以为与癌症发滋生息关连的焦灼RNA分子。在哺乳动物中，具有2-nt 3' 终端悬垂的熟习miRNA双链不错被Argonaute（AGO）识别并装载酿成RNA指令的千里默复合体（RISC）进而调控靶基因的抒发[1]。在癌症中勾引 色情，全局miRNA剂量减少被以为是癌症发生的诱因之一[2]。然而，迄今为止关于不同癌症中广宽miRNA阑珊的原因尚未被系统论述。

细胞周期的过度激活是癌细胞荒谬增殖的必要条款，因此细胞周期基因是抗癌药物研发的焦灼靶点。现存细胞周期的药物频频只可针对一种或者几种靶点，因而无法克服基因冗余性而带来的耐药性[3]。有真谛的是，许多miRNA都不错平直靶向并阻扰细胞周期基因，从而平直截至细胞增殖[4]。因此，能否通过开垦肿瘤中有残障的miRNA通路从而完满关于肿瘤细胞增殖的阻扰，就一直是一个悬而未决的生物知识题。一朝得胜，则可开发成为一种肿瘤治愈的新战术。

与miRNA不同，siRNA起头于不同RNA 依赖性RNA 团员酶(RDR) 合成的双链RNA底物。真谛真谛的是，RDR委果在总共真核生物中都已被发现，但在进化历程中，其在具有次级免疫系统的脊椎动物中丢失。在植物中，依赖RDR1的siRNA尤其参与抗病毒免疫响应，是植物私有的、最中枢的分子免疫响应通路之一[5]。连年来，跨物种生物工程已得胜应用于基础辩论和转机医学，举例来自细菌的Crispr-Cas。因此，咱们尝试从动植物免疫系统的各别开拔，在哺乳动物中进行基于植物RDR1的植物基因工程，并辩论其关连的转机医学的应用。

2022年5月26日，北京大学杜鹏辩论员课题组在Cell杂志在线发表了题为“A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency”的辩论论文。该辩论发现，在不同的东说念主类原发性癌症样本和癌症细胞系中，不成有用联结AGO2复合体的3’终端短1-nt的miRNA异构体泛泛蕴蓄。异位抒发的植物免疫卵白RDR1通过其单核苷酸加尾修饰这些AGO2游离出的miRNA双链异构体，以再行激活有残障的miRNA通路，从而特异性阻断实体瘤和白血病中癌细胞的细胞周期。

在本辩论责任中，作家主要有以下发现：

1、RDR1卵白通过靶向细胞周期泛泛阻扰癌细胞的增殖

为了在哺乳动物细胞中进行基于植物RDR1的生物工程，作家辩别从拟南芥（At）和水稻（Os）中克隆RDR1基因到基于Dox指令的慢病毒载体上。最终，本辩论取得了13个健硕的RDR1指令细胞系（包括7个实体瘤、3个白血病、3个非癌症细胞系）和2个RDR1恒定抒发的胚胎干细胞系。通过Western blot和活细胞成像，作家考据了RDR1在哺乳动物细胞中得胜完满了异位抒发。

在接下来的辩论中，令作家诧异和不测的是，AtRDR1和OsRDR1好像在体外显耀阻扰总共10种癌症细胞系的增殖，但对其他5种非癌细胞莫得影响（图1）。RDR1还不错显耀阻扰癌细胞的克隆酿成智商。在分子水平上，基于RNA-seq的基因集富集分析（GSEA）标明，AtRDR1和OsRDR1不错插手总共癌症细胞系中的细胞周期历程，但在非癌对照细胞中莫得解析作用（图2）。值得防备的是，短本事（2-3天）指令RDR1相通可显耀阻扰癌细胞中的细胞周期历程（图2），标明细胞周期通路可能是RDR1的平直作用靶点。随后，EdU/PI染色分析涌现，RDR1在癌细胞中的抒发显耀缩短了S期的细胞比例，反而增多了G0/G1期的细胞比例。因此，作家以为植物免疫卵白RDR1是一种外源肿瘤阻扰因子，它好像特异靶向并插手癌细胞中的细胞周期历程，但在非癌症细胞中却不起作用。

图1 AtRDR1和OsRDR1广谱且特异的阻扰癌细胞增殖，但不影响非癌细胞系

图2 RDR1好像特异靶向并插手癌细胞的细胞周期，但对非癌细胞不起作用

2、在3’终端短1个碱基的受损的miRNA异构体在多种肿瘤中泛泛蕴蓄

由于RDR1参与植物中的小RNA通路，作家在RDR1指令抒发前后的癌症和非癌症细胞中进行小RNA 测序。令东说念主诧异的是，作家发现指令RDR1后的癌症细胞中miRNA的合座抒发解析增多，但在非癌症细胞系中却莫得出现这种情景。随后，作家还通过miRNA通路弱点组分的敲低和AGO2-CLIP等推行，建议植物RDR1通过晋升全局miRNA抒发以特异救援癌细胞中的miRNA阑珊来阻扰细胞周期和增殖。

为了进一步辩论RDR1特异靶向癌细胞的机制，作家对已公开发表的小RNA测序数据进行系统分析，包括TCGA数据库的9980组癌症病东说念主数据以及GEO数据库的癌症病东说念主、癌症细胞系以及平时组织的数据。闭幕标明，在许多癌症病东说念主和细胞系的样本中，在3’终端短1-nt的miRNA异构体出现了多半的蕴蓄（图3）。这些3’终端短1-nt的miRNA在部分癌症样本中以至成为不同miRNA异构体中数目最多的群体（图3）。由于AGO卵白结构的零星性，2-nt悬垂的结构故意于miRNA双链参预AGO2中酿成RISC[6]。作家建议，这种1-nt悬垂的异构体，比拟于2-nt悬垂的异构体参预AGO2的恶果更低，并通过EMSA和MST推行进行了考据。同期，通过AGO2-IP的小RNA测序，作家进一步分析发现3’终端短1-nt的miRNA异构体在Input组更富集，进一步发扬出短1-nt的miRNA异构体参预AGO2的恶果更低。综上，作家建议，在癌细胞中，这种短1-nt的荒谬miRNA双链异构体不成有用地参预到AGO2中，而且不彊壮，因此可能与不同肿瘤中的miRNA剂量减少推敲。

图3 荒谬的3’终端短1-nt的miRNA异构体在不同的东说念主类肿瘤中泛泛蕴蓄

3、RDR1通过单核苷酸加尾开垦癌症中有问题的miRNA异构体

据报说念，植物RDR6同期具有RNA团员酶和核苷酸转移酶活性[7]，而在后续的小RNA测序数据分析中，作家发现具有3’端单核苷酸加尾的熟习miRNA特异富集于RDR1异位抒发的癌症细胞中。真谛真谛的是，这种单核苷酸加尾主要出咫尺3’终端短1-nt的miRNA上，但很少出咫尺注方针切割终端上。随后作家在大肠杆菌中纯化出重组的rAtRDR1和酶活位点突变的3DA mutant rAtRDR1。通过体外生化推行，作家平直阐明了rAtRDR1好像对单链miRNA和具有1-nt或2-nt悬垂的miRNA双链进行3’终端单核苷酸修饰，但不成修饰具有平终端的miRNA双链。

联结以上的发现，作家设念念RDR1倾向于识别AGO2中游离出来的具有1-nt悬垂的miRNA双链手脚底物，这些异构体尤其在癌症细胞中蕴蓄，但在非癌症细胞中不蕴蓄，并用单核苷酸加尾修饰这些有问题的miRNA。为了考据这少许，作家最初在抒发RDR1的肺癌A549细胞中进行了AGO2敲低推行，随后进行小RNA序列分析。正如预期的那样，AGO2缺失确乎进一步加强了RDR1介导的miRNA修饰，在癌细胞中短1-nt的miRNA异构体上单核苷酸加尾的比例大幅晋升（图4）。之后，体外将rAGO2与具有1-nt/2-nt悬垂的miRNA双链预孵育后再加入rRDR1进行游离miRNA双链的加尾推行，闭幕涌现与AGO2亲和力较低的1-nt悬垂的miRNA双链在与rAGO2卵白预孵育后更倾向于被RDR1修饰（图5）。

临了，作家还通过给1-nt悬垂的miRNA双链加尾后的再行联结，1-nt/2-nt外源miR-34c双链的体外转染等推行和分析，共同阐明了RDR1领有核苷酸转移酶活性，好像对AGO2中游离出的短1-nt的miRNA双链异构体进行单核苷酸修饰，以规复这些异构体对AGO2的装载恶果，并最终开垦癌症中有残障的miRNA通路。

图4 AGO2缺失可显耀增强癌细胞中RDR1介导的miRNA加尾事件

图5 RDR1更倾向于识别游离的具有1-nt悬垂的miRNA双链异构体手脚底物

4、RDR1阻扰多种小鼠实体瘤和白血病的进展

接下来，作家念念在小鼠体内考据植物RDR1的抗肿瘤作用。最初，作家将RDR1指令型癌症细胞系打针免疫残障小鼠以进行体内荷瘤推行，而且通过Dox喂水以完满RDR1的异位抒发。闭幕标明，野生型而非突变型RDR1显耀阻扰了所成肿瘤的大小、体积和分量。作家还发现，在A549，H1299和PC-3细胞所成的荷瘤中，植物RDR1好像显耀晋升癌细胞中miRNA的抒发，从而阻扰了癌细胞的细胞周期。

肖似的，作家还评估了RDR1在体内白血病小鼠模子中的抗肿瘤作用。与载体对照或突变的RDR1比拟，野生型RDR1好像显耀阻扰三种白血病细胞系（Jurkat、K562和NALM6）在免疫残障小鼠外周血中的增殖，并最终延迟异种移植小鼠的寿命。相通，RDR1不错在体内显耀增多白血病细胞中的miRNA抒发以阻扰白血病细胞中的弱点细胞周期组分，包括CDK1、CCNE2、PLK1、CDK6等，从而阻扰细胞周期。

临了，通过纳米囊泡包装体外纯化的RDR1卵白和AAV包装的RDR1，辩别在体外细胞和体内实体瘤水平上完满了RDR1的平直寄递和肿瘤阻扰（图6）。

图6 AAV寄递的RDR1阻扰小鼠体内实体瘤滋长

综上，此项辩论初度揭示了在多样东说念主类原发性肿瘤中泛泛蕴蓄荒谬的3’终端短1-nt的miRNA异构体，这为线路肿瘤发生历程中全局miRNA剂量的减少提供了新的观念。期骗植物免疫卵白RDR1，咱们通过救援癌细胞中的miRNA残障来完满广谱的抗肿瘤响应，并开发了一种新的战术来剪辑和主宰miRNA，使之成为抗拒癌症等东说念主类疾病的雄伟兵器。

步地图暗意植物RDR1 通过救援癌症中的microRNA 残障来完满广谱的抗肿瘤响应

北京大学人命科学学院/北大-清华人命科学连络中心的杜鹏为该论文的通信作家。北京大学前沿交叉学科辩论院博士辩论生皆烨和人命科学学院博士辩论生丁力为本文的比肩第一作家。北京大学前沿交叉学科辩论院博士辩论生张司文参与了部单干作，北京大学博士辩论生姚升泽（已毕业）和博士后翁健莉也对本文有焦灼孝敬。北京大学李毅和吴虹素质相助参与完成了这一责任，并赐与了任意撑握。该技俩得到了国度当然科学基金、北京大学“细胞增殖与分化”莳植部要点推行室、北大-清华人命科学连络中心和北大-启东立异基金的资助。

参考文件：

1、Bartel, D.P. (2018). Metazoan MicroRNAs. Cell 173, 20-51. 10.1016/j.cell.2018.03.006.

2、Lin, S., and Gregory, R.I. (2015). MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nat Rev Cancer 15, 321-333. 10.1038/nrc3932.

3、Otto, T., and Sicinski, P. (2017). Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy. Nat Rev Cancer 17, 93-115. 10.1038/nrc.2016.138.

4、Hydbring, P., Wang, Y., Fassl, A., Li, X., Matia, V., Otto, T., Choi, Y.J., Sweeney, K.E., Suski, J.M., Yin, H., et al. (2017). Cell-Cycle-Targeting MicroRNAs as Therapeutic Tools against Refractory Cancers. Cancer Cell 31, 576-590 e578. 10.1016/j.ccell.2017.03.004.

5、Cao, M., Du, P., Wang, X., Yu, Y.Q., Qiu, Y.H., Li, W., Gal-On, A., Zhou, C., Li, Y., and Ding, S.W. (2014). Virus infection triggers widespread silencing of host genes by a distinct class of endogenous siRNAs in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 14613-14618. 10.1073/pnas.1407131111.

6、Ma, J.-B., Ye, K., and Patel, D.J. (2004). Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 429, 318-322.

7、Curaba, J., and Chen勾引 色情, X. (2008). Biochemical activities of Arabidopsis RNA-dependent RNA polymerase 6. J Biol Chem 283, 3059-3066. 10.1074/jbc.M708983200.